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  4. 超ロングリードシーケンス

PacBio シーケンス

PacBio シーケンス
超ロングリードの次世代シーケンス「PacBio シーケンス」

PacBioRSⅡとは

最大の特長は、従来のシーケンサーと比べて、圧倒的に長いリードを獲得できること。

 最大リード長40kb、平均リード長10kb以上でシーケンス可能な「P6-C4 chemistry」により、例えば、バクテリアの完全長ゲノム配列を作成する、スプライシングバリアントの配列を読み分ける、リピート配列をシーケンスするなど、従来法では難しかった目的に対して様々な場面でその威力を発揮します。
 また、PCRを用いない、1分子レベルでリアルタイムに塩基を読み取る SMRTシーケンシング技術により、増幅によるGCバイアスのリスクを排除できる高精度な「第3世代次世代シーケンサー」です。
 PacBioシーケンスの分析単位である 1SMRT Cell は 約0.5~1Gb/Cell のデータ量を取得でき、ご要望に合わせて最適な Cell 数をご提案いたします。

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PacBioシーケンスの特徴

最大リード長 40kb、平均リード長 10kb以上

 数千塩基レベルのリード長を獲得することができる「P6-C4 chemistry」は、ゲノム全体を調べ、様々な構造変化を網羅的に把握することに長けています。
 また、完全長ゲノムを決定する際には、リードの短い従来法に比べ、コンティグの数を減らす(ギャップの数を減らす)ことができます。
 さらに、mRNAなどの転写産物の全長を 1 リード内に収めることも可能であるため、高い精度でアイソフォーム(スプライシングバリアント)を同定することも可能となります。

99.999%以上の正確なコンセンサス配列

 ライブラリー調製の工程で PCR 増幅を行わないため、増幅時のエラーや GCバイアスの影響を受けることなく、また、シーケンスエラーもランダムに発生するため、非常に精度の高いコンセンサス配列を得ることが可能です。
 この利点により、例えばホールゲノムシーケンスで一般的に適用されるカバレッジ 「×30」 でシーケンスした場合、得られたロングリードのコンセンサス精度は 「99.999%」 を超えます。このため、de novo アセンブリやターゲットリシーケンスに非常に効果的です。

PacBioシーケンス ライブラリー作製の流れ

ヘアピン構造を持つ特徴的なライブラリー

1. サンプルである2本鎖のゲノムDNAを断片化(20kb程度の断片を選定)します。
2. SMRTbellアダプター(ヘアピン構造を持つアダプター)をDNA断片の両端に付加されています。
3. 片方のSMRTアダプターの末端には、DNA合成開始に必要なプライマーが組み込まれています。
4. DNAポリメラーゼがSMRTbellアダプターに結合し、DNA配列を順に合成していきます。



 
 
 

超ロングリードだから有効となるアプリケーション例

完全長ゲノムDNAの作成

 従来の次世代シーケンスで用いられる、数百塩基単位のショートリードをアセンブルして完全長ゲノムの構築を目指す方法では、多くのコンティグが作られ、たくさんのギャップ(隙間)ができていました。
 それに対し、数十塩基の超ロングリードを獲得できる PacBIoシーケンスでは、コンティグも少なく、ギャップが生まれにくいことから、完全長ゲノムDNAを目指す場合に非常に有効な手段となります。

リピート配列のシーケンス

 従来のショートリードを繋げる方法では、各リード同士が似た配列となるため、リピート領域の中の繋がり方や、リピートの数が判別しにくいため、埋まりきらない領域として残っていました。
 それに対し、PacBioの超ロングリードであれば、リピート領域の入り口から出口までを1つのリードでカバーできるため、リピート領域全体を決定することが可能となります。

mRNAアイソフォームのリストアップ

 ショートリードを繋げる従来の次世代シーケンサーを用いたRNA-Seqでは、アイソフォーム(スプライシングバリアント)の判別が困難でした。
 それに対し、超ロングリードのPacBioシーケンスでは、1つのリードで mRNA 分子全体を網羅することができる(mRNAの全長を 1リードでシーケンスできる)ため、多様なアイソフォームが混在する場合でも、それらを全て見分けることができ、アイソフォームごとの発現解析を高精度に実施することができます。

ご依頼に必要なサンプル条件

ゲノムDNAの場合

 PacBio RSⅡは他の次世代シーケンサーと比べ、サンプル状態が結果に大きく影響いたします。右表記載のサンプル条件をお確かめの上、可能な限り条件を満たしたサンプルをご用意ください。もしも、条件に対してクリアできない項目がある場合は、事前にご相談ください。

 右表記載条件の他、以下の点をご確認ください。
● DNase, Rnaseフリーの1.5mlチューブをご使用ください(スクリューキャップ式のチューブをお使い頂くとより安心です)。
● ゲノムDNAの抽出はQiagen Dneasy kitまたはPromega Wizard kitなどを推奨致します(他のkitも使用可能です)。
● 溶出バッファーはEDTAなどが入ってないTris-HCl(PH8) バッファーを推奨致します。不純物(腐植酸、phenol類など)が入っている可能性がある場合は、お知らせください。
● お預かりしたサンプルを受領後に品質チェックを行いますが、チェック手法の違いから、お客様にて測定されたチェック結果と当方で実施した品質チェックの結果に違いがある場合がございます。可能な限り、右表条件の基準より多めにご用意ください。
 
 

total RNAの場合

 RNAを用いたシーケンスはゲノムDNAを用いた場合と比べサンプル品質の重要性が高く、特に純度は結果に大きく影響いたします。右表記載のサンプル条件をお確かめの上、可能な限り条件を満たしたサンプルをご用意ください。もしも、条件に対してクリアできない項目がある場合は、事前にご相談ください。

 右表記載条件の他、以下の点をご確認ください。
● DNase, Rnaseフリーの1.5mlチューブをご使用ください(スクリューキャップ式のチューブをお使い頂くとより安心です)。
● お預かりしたサンプルを受領後に品質チェックを行いますが、チェック手法の違いから、お客様にて測定されたチェック結果と当方で実施した品質チェックの結果に違いがある場合がございます。可能な限り、右表条件の基準より多めにご用意ください。

仕様と価格
商品コード 商品名 内容 販売価格(税別)
  •  DNAの場合   ライブラリー調製/サンプル

    145,000円
  •  シーケンス/1 SMRT Cell

    129,000円
● ライブラリー調製 1回あたり、8 SMRT Cell 分まで実施可能です。
● 1 SMRT Cell あたりの獲得データ量は約 0.5~1Gb です。ただし、サンプルによって獲得データ量は変動するため、あくまで目安としてお考えください。
● 上記シーケンスの費用には、データ解析(アセンブル)の作業が含まれます。

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納品物について

ご依頼いただいた際の解析結果については、以下を納品いたします。

●シーケンシングで得られるインサート部分の生データ(サブリード): fastqファイルです。
●アセンブルデータ:上記プリアセンブルリードをさらに de novo アセンブルして得られるシーケンスに相当します。
 
●解析結果例はこちら
 ※結果例内で付いている遺伝子アノテーション情報はオプション作業であり、基本仕様には含まれません。
 
 

その他 注意点

解析結果がいかなる結果であっても解析方法に瑕疵がない限り、一切の責任を負うものではございません。
受注後、実作業に入ってからのキャンセルは、サービスの仕様上お受け致しかねます。やむを得ない場合は、実作業分の料金をご請求させて頂きます。
お客様からお預かりいたしましたサンプルを調製する際に何らかの問題があることが判明した場合、新たなサンプルを用意して頂くことがございます。また、その問題がサンプルに起因する場合には、再調製料金を頂く場合がございます。 これに伴い、サンプルの再提供、再調製等に時間を要したことによりご依頼者に何らかの問題が生じましても、一切責任を負うものではございません。 
 感染性のあるサンプル(HCV・HIVなど)の受け入れは行っておりません。また、ヒト臨床サンプルの場合は、インフォームドコンセントを得ていること、倫理委員会の承認を得ていること、匿名化されていることをご確認ください。 
本受託解析サービスにより得られた結果が原因となり生じた損失・損害等につきましては、サービスの仕様上、責任を負いかねます。 
ご提供・ご指示いただくサンプルや手法から生じる工業所有権・安全性などの問題につきましては、一切責任を負いかねます。 
ご提供いただくサンプルの保管および返却は基本的に行っておりません。予めご了承ください。 
 データの保管を6ヶ月間は行ないます。データをお受け取りになられましたら、すぐにバックアップコピーをお取りになられますようお願いいたします。

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